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2024-03-09 21:54:03

为什么western blot 的条带有很多非特异性条带？有可能是一抗的原因吗？ - 知乎

为什么western blot 的条带有很多非特异性条带？有可能是一抗的原因吗？ - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答切换模式登录/注册生物学分子生物学医学为什么western blot 的条带有很多非特异性条带？有可能是一抗的原因吗？最近刚开始跑目的蛋白的条带，结果发现有很多非特异性条带。我的样品是从细胞里提取的蛋白，在冰上裂解30min，离心后取上清液，加了上样buffer后煮沸…显示全部关注者23被浏览95,672关注问题写回答邀请回答好问题1 条评论分享7 个回答按时间排序艾赛比奥生物易选生物专业临床前药效、药理、非GLP毒理一站式CRO 关注易选生物丨动物模型WB拍照WB显色时出现糊一大片的常见原因可能包括以下几点：1：曝光问题：这可能是由于曝光液配制比例错误、曝光液没有均匀滴在膜上、曝光时间过长导致膜上曝光液流失，或者是曝光板没有水平摆放造成的。2：蛋白问题：这可能是因为细胞提取的蛋白浓度太低或提取蛋白方法有误（特别是如果内参也出现问题的话），或者是转膜时间过短导致蛋白未充分吸附，或者是电泳液或转膜液过期导致效率下降，或者是操作粗暴导致蛋白被刮落。3：抗体问题：这可能是因为抗体浓度太低、孵育时间过短、抗体过期、孵育时蛋白面朝下导致孵育不完全，或者是孵育盒内抗体容积太少。4：电泳问题：这可能是因为电泳电压过低导致蛋白泳动速度降低而弥散，或者是转膜时夹心没有夹紧导致部分蛋白弥散转印。5：过度转移：如果电泳转移的时间过长或电流设置过高，蛋白质可能会过度转移到膜上，导致条带模糊。6：膜处理问题：条带模糊也可能与膜处理有关，如膜的湿润不均匀、膜与凝胶的接触不良或膜上存在污染物等。7：抗体非特异性结合：如果检测的抗体不是特异性的，可能会出现非特异性结合导致背景值升高。8：蛋白质降解：样品中蛋白质降解可能会导致背景值升高。9：膜过于湿润：膜过于湿润可能会导致背景值升高。易选生物丨动物模型WB拍照1：曝光液的比例按1:1配置。曝光液均匀的滴落在膜上，曝光时间不宜过长，曝光板水平摆正。2：提取的蛋白浓度不宜过低。提取蛋白时应该低温操作。转膜时间大约70分钟左右。电泳液和转膜液要常换。大约2天换一次。转膜的时候动作一定要轻柔。3：一抗浓度一般为1:4000或者1:5000。四度过夜或者4度2小时敷育。二抗浓度一般为1:4000或者1:5000。常温摇床孵育一小时。抗体要在保质期内使用。蛋白面朝上，抗体量要充足，使抗体完全覆盖住膜。4：电泳的时候电压不宜过低，浓缩胶一般为80V，分离胶为100-120V。转膜夹一定要夹紧。5：膜必须完全湿润，且上面没有任何污染物。膜和胶要完全贴合，中间不能有气泡。6：抗体为特异性抗体。7：样品低温保存，尽量低温快速的使用，并及时放回冰箱保存。大量样品可放入-80度保存，少量样品放入-20度保存。8：膜不宜过度湿润。易选生物是一家专门为新药研发企业提供专业临床前药效、药理、非GLP毒理一站式实验服务的CRO公司，用专业的技术和高效的沟通帮助客户提高新药研发的效率。上海易选生物科技有限公司（简称：易选生物，esebio）：易选生物成立于2019年，拥有一支由海内外知名大学博士研究生的技术性人才梯队，一家专业的生物医药临床前综合研发服务CRO，为全球的医药企业和科研机构提供专业的临床前药效学评价服务。目前，已形成百余种成熟的动物疾病模型，涵盖神经退行性病变、心脑血管、精神疾病、泌尿系统、免疫系统、呼吸系统、消化系统、皮肤、肿瘤、内分泌系统、眼耳鼻喉等研究等领域。发布于 2024-01-17 11:43赞同 1添加评论分享收藏喜欢收起曼博生物已认证账号关注Hello，各位未来的科研大佬们~你们还整天呆在实验室苦逼的做Western Blot吗？有没有因为封闭不完全导致条带背景不能满足实验要求而捶胸痛哭，或者苦于封闭时间过久而耽误自己“美好”的科研人生。今天就让我们来谈一谈WB中封闭过程，在此之前，先让我们回顾一下Western Blot过程：蛋白免疫印迹（Western Blot）是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。WB可用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析，该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。一、WB的封闭过程当我们辛辛苦苦做完的免疫印迹实验，结果却出现背景过高，信号又太弱的现象，这就很有可能是你的封闭过程没有处理好的原因。在这里就让我们先来了解一下封闭过程，我们在做western blot实验时，会用到固相载体（如NC膜，PVDF膜），在这些固相载体表面有很多孔洞，通过上游的电转过程，凝胶上的蛋白被转移到固相载体上，蛋白以机械填补（堆积）和吸附的方式结合于表面。也就是说蛋白被塞进了表面的孔洞里面，但由于蛋白并不是连续的，它们会存在许多空隙，并且我们用的抗体本质也是蛋白，也会被吸附在孔洞之中，这样就会有许多非特异性吸附，从而干扰正常结果的呈现。而常见的封闭过程就是利用封闭液中的蛋白让其与固相载体表面的空白位置结合，同样以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，从而将结合位点填补和覆盖，避免后期一抗的非特异性结合，我们将这个过程称之为 “封闭”。同样，这两种作用使封闭液中的蛋白能够牢固的结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。从而使结果呈现的更具有说服力，表达意义也更明显。总的来说，封闭过程是为了避免高背景和非特异性条带的发生，这么一说，大家对封闭过程有了一个大致的了解了吧，是不是觉得很简单，虽然简单但并不意味着封闭就不重要，恰恰相反，他是整个WB承上启下的一环，也是你整个实验成功的关键。二、常用的封闭液从上述我们可以看出，封闭过程是Western Blot 至关重要的一部分，所以正确的封闭液选择可以让抗体更好更准确的和抗原结合，为成功的WB奠定基础。虽然这个步骤操作简单，但是封闭液的选择却是令很多科研人头疼的问题。接下来我带大家了解一下用于WB实验常用的一些封闭液。1、脱脂奶粉脱脂奶粉属于最经济的封闭缓冲液了，需要时甚至可以直接从超市购买（实验中途饿了也可以用温水冲一袋，还不会长胖，哈哈），通常使用浓度为 2.5-5% （w/v）。但由于脱脂奶粉是许多种蛋白质的混合物，里面可能存在生物素和碱性磷酸酶，一定程度上可能会导致背景污染，因此不适合生物素—亲和素的检测方法。此外，其中含有一定量的酪蛋白（casein），是一种磷蛋白（phosphoprotein），如果你的目标蛋白是磷蛋白的话，封闭过程不要选择脱脂奶粉作为封闭液，否则会有很多背景信号（background signal）。即使你的目标蛋白不是磷蛋白，因为是蛋白质的混合物，所以也容易产生较高的背景信号。2、牛血清白蛋白（BSA）牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，简称BSA）是从牛血清中提纯之后的一种球蛋白，也是实验室除了脱脂奶粉之外最常用的封闭缓冲液。BSA不是磷蛋白而且是单一蛋白，不会出现封闭磷酸化蛋白时出现背景过高的现象，但是提纯过程中有可能含有IgG或其他血清蛋白等污染物，这些蛋白都可以和哺乳动物抗体产生交叉反应，从而增加非特异性背景信号 (non-specific background noise）。3、血清血清是许多蛋白质的混合物，同样可以被用来当做封闭剂。首先，血清能像BSA一样封闭一些非特异性的蛋白结合。此外，待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区（Fc）结合，与抗体特异性无关，因为封闭血清中有抗体，因此可以封闭掉实验用一抗及二抗和样本中Fc受体之间结合，进一步降低非特异性结合。通常使用的浓度为 5-10%（w/v）。但像BSA一样，它含有免疫球蛋白和血清蛋白，会和哺乳动物抗体产生交叉反应。三、Q-BLOCK 一分钟无蛋白封闭缓冲液通过对不同种类封闭液的一个学习，你是不是对封闭过程有了一个新的理解。但又开始迷茫自己今后的实验该选择什么样的封闭液？确实，如果选择了不适用的封闭液，可能会导致自己辛辛苦苦做的实验结果变得惨不忍睹，不要担心，在这里给大家推荐一款全能性的无蛋白封闭缓冲液，它能够满足你绝大多数封闭需求。“泉品”Q-BLOCK 一分钟无蛋白封闭缓冲液，它是一种高效快速的封闭缓冲液。多用于Western Blot封闭阶段，此外实验条件允许的情况下还可用于Wetern Blot过程中抗体（一抗、二抗）的配置。纯化学配方且不含蛋白质，能有效防止蛋白质交叉反应，短时间内能够有效提高被检测信号的信噪比。泉品Q-BLOCK一分钟无蛋白封闭液1、快速高效传统的WB实验封闭过程，常采用BSA(牛血清白蛋白)、5%的脱脂奶粉、酪蛋白(Casein)等的封闭液，这些封闭液使用时为了充分封闭住固相载体上的抗原位点，一般需要室温孵育1-2h或者4度封闭过夜，延缓了实验进度，并且封闭时间过长会加大实验风险，导致结果的不稳定性。Q-BLOCK一分钟无蛋白封闭缓冲液针对这一点，将封闭时间缩短至一分钟，极大的加快了整个WesternBlot过程，另外，本产品无需稀释，即取即用，极大的节省了操作流程。2、无蛋白质干扰采用无蛋白配方，避免抗体与封闭剂的非特异结合，有效降低了背景。同时，本封闭剂无内源的磷酸化蛋白及生物素，对磷酸化特异抗体及生物素的检测也不会产生干扰。3、性能高本封闭剂不与蛋白产生非特异性结合，因而只封闭膜而不会屏蔽样品蛋白的抗体识别位点，大大提高了抗体检测灵敏度。提供比传统封闭缓冲液更好的特定信号和更少的背景噪声，有效提高信噪比。4、节省抗体此类封闭液可应用于WB后续实验中抗体的配置，并且Q-BLOCK是无蛋白配方，用于抗体配置可有效延长抗体保存时间。能够节省抗体用量，性价比更高。四、实验说明1、从图中可知，与其他品牌相比，Q-BLOCK不仅操作时间短，更有效提高信噪比。2、纯化学配方、不含蛋白质，稀释抗体可延长保存时间，抗体重复使用次数增加，极大的提高了抗体利用率：这款封闭液是我们“泉品”现在主推的一款产品，品质上肯定对得起你的选择，使用过程中若遇到相关技术问题可随时与我们联系，我们一定竭尽全力为你的实验保驾护航，使用过程没有烦恼。五、关于泉品“泉品” 拥有专业化的资深团队，负责产品的研发，生产，质控，以及品牌推广。“泉品”的理念是“有泉·有品”，泉本意指水源，水是万物之源，寓意滋养，创新，朝气蓬勃，充满希望。品，本意为众多，如《易经》里“云行雨施，品物流形”，现本意又为品质。“泉品”以创新和高品质为核心价值理念，通过自身研发团队，以及与国内外专业科研团队强强联合，不断创新，为生命科学和医药研发行业提供高品质产品和服务。为了追求给客户带来更好的服务和体验，针对生物医药企业和科研用户，我们将秉承“服务至上”的理念，为用户提供“泉品”的样品试用、技术支持、订单执行及配送服务。泉品现有产品包括：澳洲胎牛血清、一分钟无蛋白封闭缓冲液、自动化蛋白免疫杂交印迹仪（western Blot专用）、高性价比移液吸头、不同规格离心管、血清移液管、实验室移动热转印标签打印机、涂布棒、细胞过滤筛、试剂槽、接种环等，其他新增产品敬请期待。官网网址：https://www.quan-lab.com/发布于 2023-05-12 09:25赞同 7添加评论分享收藏喜欢

WB（Western Blot）实验结果条带不OK大全！ - 知乎

WB（Western Blot）实验结果条带不OK大全！ - 知乎切换模式写文章登录/注册WB（Western Blot）实验结果条带不OK大全！一起实验网Western Blot技术从提出至今已经有四十余年了，如今仍然广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测等多个方面。然而想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片，还是具有一定挑战性的，本期即为大家整理了结果条带可能出现的问题及其解决方法，帮助大家少走弯路。01.没有任何显色01.没有任何显色原因：具体原因比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。经验：上图展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一张白片。02.高背景02.高背景原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够。解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。经验：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方有弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。其实只要注意操作规范,不偷工减料就很容易避免。03.非特异性条带03.非特异性条带原因：一抗非特异性与蛋白结合。解决办法：更换一抗。经验：绝大多数是因为一抗不好，无法判断哪一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。04.条带中出现边缘规则的白圈04.条带中出现边缘规则的白圈原因：电转中膜和胶之间存在气泡。解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡。经验：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，然后盖上海绵。注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。05.条带中间出现白色（反白）05.条带中间出现白色（反白）原因：中心部位高浓度HRP把底物消耗过快，中间部位底物消耗结束之后就不发光了解决办法：降低蛋白量，降低一抗和二抗的浓度。经验：如果你足够迅速，可以在中间部位底物消耗之前就把X光片给定影出来，但是时间很难把握，建议还是从降低蛋白量，降低一抗二抗浓度入手。06.出现黑点和黑斑06.出现黑点和黑斑原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合。解决办法：封闭牛奶一定要纯，封闭结束之后要洗。经验：我们常常是等到要封闭的时候发现没有牛奶，然后匆匆忙忙用PBST/TBST配置，配的匆忙的时候往往不管是否已经完全溶解，如果没有完全溶解的情况下加牛奶倒膜上，会导致很多不溶性颗粒附着在膜上，这就会导致发光时候膜上的黑点。所以牛奶溶解之后，最好静止一下，然后轻轻地吸取上层牛奶进行封闭，封闭结束之后一定要洗三遍之后再加一抗07.条带拖尾07.条带拖尾原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长。解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。经验：这种情况很容易出现，因为很多原因都可能导致这一个结果。一般来说，蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量，因此不太可能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。08.出现重影08.出现重影原因：荧光强度比较高，在压片时，放好之后不小心又轻微移动了一段距离。解决办法：X光片放上去之后，就不要动了，即使放歪了也没关系。经验：有的时候出现重新刚好在上下位置，并且重影会相对弱一些，不要误以为抗体识别了该蛋白的另外一种异构形式。09.出现非均一性背景09.出现非均一性背景原因：膜可能曾经干过。解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干。经验：在封闭的时候，洗一抗，洗二抗，以及发光的时候都时刻需要注意蛋白面不要风干，风干之后结果很可能就是这个样子。注意与高背景区别。10.某个条带变形10.某个条带变形原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒。解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。经验：很多实验室中使用的不是最新的设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年之后，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水、SDS、Tris缓冲液要注意不要有杂质。11.条带呈哑铃状11.条带呈哑铃状原因：配置胶有问题。解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用。经验：出现哑铃最大的可能是胶没有配置好，胶凝固后不均一。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白自然被推挤到两边。12.最边缘条带弯曲12.最边缘条带弯曲原因：电泳电流不均一解决办法：换用新的电泳槽；不使用两遍的两孔经验：一般我们使用的是10孔的的胶，如果你上样刚好10个孔，那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间，这样电场均一。13.其他问题（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应；（2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰；（3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。14.电泳过程中出现现象及问题 (1）整个条带呈 “ ︶ ” 状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化；（2）整个条带呈“ ︵ ”：凝胶左右两头没有凝固好；（3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好；（4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒；（5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错；（6）在分离胶中跑不动：Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。不要以为看完这篇干货就可以撸起袖子大干一场，实验的奥妙和变数太大，只靠理论知识还远远不够。你在实验过程中又遇到了哪些问题呢？欢迎发信息和我们沟通哦~资料来源：http://www.360doc.com/content/17/1128/14/41787016_707890426.shtml发布于 2022-04-21 10:19wb实验生信分析生物信息学赞同 1236 条评论分享喜欢收藏申请

WB实验条带问题？原因分析和解决方法都在这里！ - 知乎

WB实验条带问题？原因分析和解决方法都在这里！ - 知乎切换模式写文章登录/注册WB实验条带问题？原因分析和解决方法都在这里！Elabscience聚焦细胞检测领域，提供一站式解决方案Western Blot虽是实验室最常用的蛋白分析技术，但是由于它步骤繁琐、操作流程长、影响因素多，所以，导致我们在做实验时会遇到各式各样的问题。今天我们总结了一些WB实验中经常遇到的各种“奇葩”条带问题，并为你推荐了常用的解决方法，希望对大家有所帮助。一、目标条带没有信号原因分析解决方法样品中可能含有蛋白酶，使蛋白样品分解成小分子。添加蛋白酶抑制剂。目标蛋白浓度过低（低于检测下线）。加大上样量或提高目标蛋白浓度。转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上，或者转膜时间过长导致样品转穿。控制转膜时间并选择适合的转印膜。一抗的特异性不佳，导致一抗无法识别目标蛋白。选用高品质抗体。一抗反复使用后导致效价降低，尽管还能与目标蛋白连接，但连接蛋白的数量太少。一抗不宜反复使用。洗脱过渡导致与一抗相结合的目标蛋白被洗掉。洗脱时间的时间和频率应有效控制，一般建议3次10分钟。二. 图片背景过高，难以分辨条带原因分析解决方法一抗浓度太高，导致抗体非特异性结合。降低一抗浓度。洗膜的时间和次数不够，导致其他蛋白没有清洗干净。提高洗脱时间和频率。封闭物用量不足。提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜。封闭物使用不当。检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭。封闭时间不够。室温37度封闭1小时以上，4度封闭过夜。一抗稀释度不适宜。对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育的温度偏高。建议4℃结合过夜。三、膜上出现黑点和黑斑原因分析解决方法膜上其他部位与一抗或二抗非特异性结合，配置的封闭液可能没有完全溶解，使不容颗粒附着在膜上从而导致发光时候膜上形成黑点。配置封闭液后最好静止一下，封闭牛奶一定要纯，封闭结束之前要清洗三遍之后再加一抗。抗体与封闭试剂反应。使用前过滤封闭试剂。HRP 偶联二抗中有聚集体。过滤二抗试剂，去除聚集体。四、出现非特异性条带原因分析解决方法一抗非特异性与蛋白结合，此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好。更换一抗。目的蛋白有多个修饰位点，有些一抗还能结合其他蛋白的结合位点。更换一抗品种。蛋白样品降解，蛋白酶将目标蛋白分解成若干个蛋白，而这些蛋白同样可以被一抗识别。添加蛋白酶抑制剂。五、条带中出现整条白色空斑原因分析解决方法过高的蛋白上样量或一抗和二抗浓度过高都会促使底物过快的消耗，导致我们在做化学发光检测时，发光底物已经消耗殆尽而形成空斑。减少蛋白上样量、稀释一抗和二抗的浓度。六、条带中出现白圈原因分析解决方法转膜时候，膜与胶之间有气泡。转膜时气泡。制作“三明治”时，注意赶走气泡。通常将电转液倒入一个盘子里，液体高度与第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇一些转膜液，把电泳胶用清水清洗后平铺在滤纸上，随后在确认滤纸与胶之间无气泡后，再往胶上浇一些电转液，之后用双手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜两侧中间，使膜成U型，再将U型底部接触到胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样可以减少气泡。上层滤纸同样用U型的放置方法，可以用玻璃棒贴实一下，然后盖上海绵垫。七、条带拖尾原因分析解决方法这种情况很容易出现，因为导致条带拖尾的原因很多，可能性较大的是一抗浓度太高，作用时间太长或蛋白量过大。根据情况调整蛋白量，同时降低一抗的浓度，缩短一抗的时间。八、条带变形原因分析解决方法胶体中存在气泡，或不溶性杂质，胶不均不平整。配胶时用的小烧杯，水，SDS，tris等等干净无杂质。贴边角加入液体，凝固时避免大幅度动作触碰。九、条带呈哑铃装原因分析解决方法出现哑铃装条带的问题，最大的可能性就是胶没有配置好，胶凝固后不均一。另外还有一种可能就是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉淀在孔的中间，蛋白被挤到两边。把胶配好，不合格的胶坚决不能用。十、最边缘条带弯曲原因分析解决方法电泳电流不均一。换电泳槽，或者不使用两边的孔。十一、背景非均一性原因分析解决方法膜可能干过。膜可能干过。膜可能干过。膜可能干过。膜可能干过。膜可能干过。膜可能干过。膜可能干过。在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干掉，确保蛋白面不要被风干很长时间，一定要用不漏水的封闭盒并盖上盖子，防止过夜16个小时液体流失。十二、条带呈“微笑”或“倒微笑”状原因分析解决方法条带呈“微笑U”状，凝胶冷却不均一，电泳槽老化。更换电泳槽。条带呈“倒微笑∩”装，凝胶左右两头没有凝固好。重新制胶。十三、其他问题原因分析解决方法蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。以上是我们对WB条带出现各种状况及解决方法的一个总结，希望可以对大家有所帮助。如果各种原因都试变了，还是做不好WB实验怎么办？推荐——Elabscience整套的WB试剂盒！Elabscience结合客户需求，特推出Western Blot检测试剂盒，为您顺利完成Western Blot实验提供整套解决方案，免去你每个步骤的试剂都要一一去采购、配比、验证可用性等等，也不用每一步流程都需要反复去摸索合适的实验条件，极大的减少了人为差异性，再也不担心出现各种“奇葩”条带了！这个试剂盒里面包含了完整的经典WB所需全套试剂，从蛋白提取到ECL底物曝光在内，应有尽有。并且还有两种孔径的PVDF膜可供选择，整个配套的试剂盒可供完成5块凝胶(约50个样本)对应的 WB 试验，一点儿都不浪费!另外，还额外赠送一支20µL的Goat Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP，真的很良心了，跑出来的图，也是真心漂亮：跑出漂亮条带的秘诀，你学会了吗？编辑于 2022-06-15 15:31wb实验免疫蛋白印迹赞同 1294 条评论分享喜欢收藏申请

WB最常遇到的20个问题 | 有图有真相(二） - 知乎

WB最常遇到的20个问题 | 有图有真相(二） - 知乎切换模式写文章登录/注册WB最常遇到的20个问题 | 有图有真相(二）甄钰ZENETIX科研耗材无菌无酶用甄钰九、转印不均匀十、检测信号弱或无信号十一、非特异条带非特异性条带是指除目标蛋白以外的条带，杂带较多影响结果判断，且结果不可靠。下面我们结合实际案例对其可能原因进行分析，并找出相对应的解决方法，见表。表非特异性条带多可能原因和解决方法十二、条带拖尾十三、条带变形发布于 2023-09-11 17:41・IP 属地广东wb实验赞同 1添加评论分享喜欢收藏申请

WB条带大小与预期不符或多条带？完整版原因分析+解决方案来啦 | Abcam

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WB条带大小与预期不符或多条带？完整版原因分析+解决方案来啦

疑难靶点实验贴士| Abcam中文官网

WB实验疑难解答，及58个热门靶点WB相关关键点解析 | Abcam

WB实验步骤关键点合集| Abcam中文官网

我们上一期讲解了WB条带无信号或信号弱的问题及解决方案，在做WB实验时，你是否经常还会遇到检测条带大小与预期不符或多条带等问题？

预期实验结果图图1 比靶标蛋白分子量小的位置出现多条条带图2 比靶标蛋白分子量大的位置出现多条条带图3 不同分子量大小的位置出现多条条带图4 检测条带小于预期分子量大小图5 检测条带大于预期分子量大小

当WB实验出现检测条带与预期不符或者多条带等现象时，我们归纳整理发现，主要是由于样本和靶标自身特性以及WB实验流程中的样本制备、抗体孵育和封闭等具体实验细节问题所引起的，接下来将详细介绍一下出现检测条带与预期不符及多条带等现象的原因及具体解决方案，一起来看看吧！

样本和靶点特性1. 细胞传代次数过多，使其蛋白表达不同，导致检测条带大小与预期不符或多带现象。可通过如下建议解决：使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。2. 蛋白样本降解，导致检测蛋白质分子量降低或多带现象。可通过如下建议解决：在样品缓冲液中加入足量的蛋白酶抑制剂。3. 体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化和糖基化等，导致检测条带大小与预期不符或多带现象。可通过如下建议解决：查阅文献，检查是否有多带报道；我们总结了WB检测易出现多带现象的热门靶标实验结果及原因解释，供大家参考（附录5：热门靶标蛋白多带现象及原因解释）。以部分热门靶标为例，欢迎点击上方“附录5”链接查看全部靶标信息

由于翻译后修饰（PTMs），如磷酸化和糖基化或选择性剪切变异体，许多蛋白实际检测的条带分子量略高于预期或出现弥散条带；我们总结了实际检测条带大小与预期不符的热门靶标WB检测结果示例，及原因解释，供大家参考（附录6：热门靶标蛋白检测条带大小与预期不符及原因解释）。为了确认额外的条带是由翻译后修饰引起的，可以用合适的试剂处理样品来处理修饰过的蛋白质。例如，PNGase F可以去除糖基化，当处理后再进行WB实验时，额外的糖基化条带应该会消失；我们总结了实际检测条带大小与预期不符的热门靶标WB检测结果示例，及原因解释，供大家参考（附录6：热门靶标蛋白检测条带大小与预期不符及原因解释）。以部分热门靶标为例，欢迎点击上方“附录6”链接查看全部靶标信息

4. 靶标蛋白含有多个异构体或剪切体，导致检测条带大小与预期不符或多带现象。可通过如下建议解决：查阅文献，检查是否有异构体；我们总结了多个热门靶标预测分子量大小及异构体信息，供大家参考（附录4：热门靶标蛋白分子量）。以部分热门靶标为例，欢迎点击上方“附录4”链接查看全部靶标信息注：（1）有些特殊蛋白，由于翻译后修饰、剪切或降解等因素影响，WB实际检测分子量大小可能与预测不符，或有弥散现象。（2）有些蛋白可能有多个异构体，因此WB检测时可能会有多带现象。（3）同一蛋白的多个异构体表达模式可能不同，即不同样本中，未必都能检测到同一蛋白所有的异构体。查看免疫原序列，判断抗体是否识别异构体或剪切体。5. 检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白。可通过如下建议解决：查阅文献，或BLAST搜寻，使用说明书推荐的细胞株或组织。

实验流程样本制备靶蛋白形成多聚体可通过如下建议解决：这可能出现高分子量的额外条带，它们的分子量可能是预期条带的2倍或3倍；我们总结了实际检测条带大小与预期不符的热门靶标WB检测结果示例，及原因解释，供大家参考（附录6：热门靶标蛋白检测条带大小与预期不符及原因解释）。SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10分钟而不是5分钟，使蛋白质解聚。对于多次跨膜蛋白，可尝试不煮样或使用较温和的煮样方式。封闭条带为非特异性条带可通过如下建议解决：应用封闭多肽来区分特异性和非特异性条带，只有特异性条带能被封闭从而消失。一抗孵育一抗浓度过高，高浓度时常出现多条蛋白带可通过如下建议解决：降低抗体浓度和/或孵育时间。抗体未经纯化可通过如下建议解决：使用亲和纯化的抗体，减少非特异条带。二抗孵育二抗浓度过高，高浓度产生非特异性结合可通过如下建议解决：降低抗体浓度，增加二抗对照（只加二抗不加一抗的对照）。下一期，我们将把目光集中到WB出现高背景和其他问题（除无信号、条带问题外），并给大家提供原因分析和优化方案，记得来围观哦。

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『WB实验』出现非特异条带或多带现象是怎么回事？ - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答切换模式登录/注册分子生物学细胞生物学wb实验『WB实验』出现非特异条带或多带现象是怎么回事？关注者2被浏览11,377关注问题写回答邀请回答好问题添加评论分享2 个回答默认排序维真生物已认证账号关注(1) 细胞传代次数过多，使其蛋白表达不同：使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。(2) 体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等：查阅文献，使用试剂使样品去磷酸化、去糖基化来验证翻译后的修饰。(3) 蛋白样本降解（蛋白质分子量降低）：在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。(4) 检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白：查阅其它文献报道，或BLAST搜寻，使用说明书推荐的细胞株或组织。(5) 一抗浓度过高，高浓度时常出现多条蛋白带：降低抗体浓度和/或孵育时间。(6) 二抗浓度过高，高浓度产生非特异性结合：降低抗体浓度，增加二抗对照（不加一抗）。(7) 条带为非特异性条带：应用封闭多肽来区分特异性和非特异性条带，只有特异性条带能被封闭从而消失；提高封闭液浓度，如从5%提高到7%，增加封闭时间和/或温度，向封闭缓冲溶液中加入0.05%的Tween 20，抗体稀释液采用相同的封闭液。(8) SDS使抗体和蛋白条带发生非特异性结合：转膜后洗涤印迹膜，在免疫检测过程中不要使用SDS。(9) 抗体质量：尝试使用不同的抗体。(10) 抗体未经纯化：使用亲和纯化的抗体，减少非特异条带。(11) 靶蛋白形成多聚体：SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10分钟而不是5分钟，使蛋白质解聚。编辑于 2022-06-27 09:33赞同 2添加评论分享收藏喜欢收起Star皆空科研行业从业人员关注“出现杂带”以及“条带位置不符合预期”，这两种情况需要分开讨论：第一种情况：蛋白转录及翻译后的修饰，该因素是引起杂带的最常见原因。转录后，由于选择性剪切的作用，同一个转录本会翻译出不同大小的蛋白，这类蛋白称为该蛋白的剪接体。在UniProt查询蛋白时，可以在“Sequences ”部分看到该蛋白已报道过的Isoforms。在进行实验前，需要比对每个剪接体造成的变化是否影响了目标蛋白的对应结构域，进而判断本研究种涉及的蛋白到底应该检测哪条主带，又或者哪几条带。我们在阅读文献时所看到的WB实验图片中，也偶尔会出现双条带或多条带。这些现象是研究过程中值得解释和讨论的。在进行Western Blot实验时，我们应该清楚，针对某些目标蛋白的检测结果并不一定是只有一条带。此外，蛋白在翻译完成后，可能会进行各类修饰，引起蛋白大小明显改变的多为糖基化修饰。在一些分泌型蛋白和膜蛋白上，糖基化位点的存在会将一个蛋白的大小增加至两倍或者更多，且由于组织的特异性，同一个蛋白在不同样本中的糖基化修饰差别很大。同时，有的蛋白存在前体和成熟体，这种蛋白一般在研究时，应该会有所了解，但为了防止信息差，依然需要跟客户解释这个蛋白本身的特性。第二种情况比较偶发：在细胞的培养状态不太好或细胞传代过多的情况下，由于基因组的变异，细胞会表达某种蛋白的截短蛋白。这种被截短、剪接后的靶蛋白可能是未经报道，但由于仍存在抗原识别位点（或抗原表位）而被识别出来。一般情况下，可以通过裁膜避免。第三种情况：蛋白等电点。蛋白质本身是有电荷的，当处于某一个pH值时，蛋白质电荷会被中和，那么该处的数值我们称为等电点pI。大部分的蛋白质的等电点小于6，所以我们在中性的电泳环境中，蛋白因为等电点小于pH值，因此带负电荷，而电泳是蛋白从负极向正极迁移的过程，带负电的蛋白在电场中，不会受到阻力。但是有的蛋白等电点比较大，大于7甚至接近8，这时，由于电泳条件不足以中和电荷，使得蛋白质带正电，在电场中迁移受到阻力，由此产生蛋白分子量变大的错觉，因此marker仅能作为参考，而实际的主带仍然要结合蛋白特性进行判断。第四种情况：样本保存和冻融。反复的冻融，或者蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂失效，会造成蛋白质的降解，引起多条带的情况出现，但这种情况一般是以“拖尾”的形式居多。第五种情况：大分子的蛋白本身会发生降解，但是由于观测的条带在比较大的marker附近，降解的较小片段在实际裁膜过程中，基本检测不到。同时，煮沸蛋白的时间不够，冻融后没有煮，会造成蛋白形成同源多聚体的形式，在目的大小两倍，或者多倍的地方出现条带。发布于 2024-01-06 14:34赞同 2添加评论分享收藏喜欢收起

蛋白质印迹（Western blot）疑难解答和建议| Abcam中文官网

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这些疑难解答提示可帮助您解决蛋白质印迹问题，包括无信号、高背景、多条带等问题的常见原因。您也可以通过手机访问 Abcam App 获取我们的实验方案，Abcam App 可提供多种实验方案、技术支持和实用工具，方便现场科研工作者随时随地访问。更多信息。打印蛋白质印迹疑难解答提示。

目录无信号背景偏高多带现象背景有不均匀的白色斑点背景有黑色斑点深背景出现白色条带（非预期背景）分子量蛋白标准条带呈黑色目的条带染色过低/过高“微笑”条带相同的蛋白杂交出现大小不均匀条带凝胶染色不均匀

无信号一抗和二抗不匹配二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白使用高浓度抗体，延长 4℃ 孵育时间（如过夜）。封闭剂和一抗或二抗有交叉反应使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶）。一抗不识别测试物种中的蛋白参照说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照。抗原量不足每泳道蛋白上样量不低于 20-30 μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。组织中目的蛋白含量低浓缩使信号最大化（例如检测核蛋白要用核裂解物）。转膜不充分使用可逆染色剂例如丽春红 S 检测转膜效果,检查转膜操作是否正确。PVDF 膜需预先浸在甲醇中，然后浸到转移缓冲液中。洗膜过度勿过度洗膜。一抗失效使用新鲜抗体，重复使用有效浓度会降低。二抗受叠氮钠抑制避免叠氮钠和 HRP 标记抗体一起使用。检测试剂盒过期和底物失活使用新鲜的底物。背景偏高未进行非特异性封闭或封闭不充分延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂。Abcam 推荐 5% 脱脂奶粉、3% BSA 或血清封闭 30 分钟。这些可以包含在抗体缓冲液中。一抗浓度过高稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体孵育更长时间（耗时长但特异性结合最好）。孵育温度过高 4 ℃ 下孵育。二抗与封闭剂非特异性结合或反应设置二抗对照(不加一抗)。一抗或二抗与封闭剂有交叉反应在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如吐温 -20。脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用 BSA 代替奶粉作为封闭剂。在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如吐温 -20。脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用 BSA 代替奶粉作为封闭剂。未结合蛋白质洗涤不充分增加洗涤次数。膜的选择导致的高背景NC 膜比 PVDF 膜背景低。膜干燥。在孵育过程中防止膜变干，在任何步骤都保证膜有充分的反应液，放入搅拌子不断搅动或轻轻振荡使膜浸在溶液中，避免出现干膜现象。多带现象细胞传代次数过多，使其蛋白表达不同使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等查阅文献，使用试剂使样品去磷酸化、去糖基化来验证翻译后的修饰。蛋白样本降解（蛋白质分子量降低）在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白查阅其它文献报道，或 BLAST 搜寻，使用说明书推荐的细胞株或组织。一抗浓度过高，高浓度时常出现多条蛋白带降低抗体浓度和/或孵育时间。抗体未经纯化使用亲和纯化的抗体，减少非特异条带。条带为非特异性条带应用封闭多肽来区分特异性和非特异性条带，只有特异性条带能被封闭从而消失。靶蛋白形成多聚体SDS-PAGE 电泳上样前，煮沸 10 分钟而不是 5 分钟，使蛋白质解聚。背景有不均匀的白色斑点转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均转膜过程中尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动。背景有黑色斑点抗体结合了封闭剂。过滤封闭剂。深背景出现白色条带（非预期背景）一抗或二抗加入过多稀释抗体的浓度。分子量蛋白标准条带呈黑色抗体和分子量蛋白标准发生了反应在分子量蛋白标准和第一个样品之间增加一个空白条带。目的条带染色过低/过高分离不彻底。改变凝胶比例：分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶。“微笑”条带迁移速度过快。降低电泳电压。电泳温度过高（改变了 pH 值和迁移速度）降低迁移速度或低温电泳(冷库或冰上)。相同的蛋白杂交出现大小不均匀条带制备凝胶时凝胶凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均匀参照凝胶的配方，在凝胶中加入适量 TEMED，放置时在凝胶顶部加入适量 0.1% SDS（水稀释）以防凝胶变干。凝胶染色不均匀细菌污染4°C 保存抗体并使用新鲜的缓冲液浸泡凝胶。抗体量不足确保在振荡孵育时抗体充分浸没膜。浏览其它蛋白质印迹相关实验方案和技术。观看简单易懂的实验方案视频。

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如何解决 WB 非特异条带及高背景？问题排查+案例解析

2020-09-09 20:55:48　来源: 生物学霸

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常有小伙伴抱怨：走过最长的路，就是 WB 实验的弯路。在上一期，我们的指南教大家如何应对常见的的问题。WB 实验时，还会遇到各种奇葩现象，比如非特异性条带和高背景，怎样才能获得背景干净的条带呢？这期我们继续来解疑。非特异性条带，杂草丛生为哪般？WB 显色后膜上有非特异条带或高背景是实验常见的问题，每一个实验细节可能会决定成败，例如抗体稀释液中 NaCl 成分和脱脂牛奶的比例就与非特异条带密切相关，下图的示例中，5% 脱脂奶粉和 0.5M NaCl 的体系下，非特异性条带更少。利用 R&D Systems 兔抗人 PTP1B 亲和纯化多克隆抗体（货号 AF1366）对 WB 实验进行优化。每个样本裂解 1×105 个细胞，并溶于 SDS 胶缓冲液进行 SDS-PAGE 蛋白分离：人 HeLa 细胞（Lane1）、MCF-7（Lane2）和 TF-1（Lane3）。电泳后，蛋白转膜至 Immobilon-P 膜，并在下述条件下免疫印迹，曝光时间为 30s。A，5% 脱脂奶粉封闭，一抗浓度：1.0 mg/mL，溶于 2% 脱脂奶粉和 0.15M NaCl；B，5% 脱脂奶粉封闭，一抗浓度：1.0 mg/mL，溶于 5% 脱脂奶粉和 0.15M NaCl；C，5% 脱脂奶粉封闭，一抗浓度：1.0 mg/mL，溶于 5% 脱脂奶粉和 0.5M NaCl。除以上原因，其它与实验体系有关的原因及解决方法总结如下：下面重点了解，与样品中目的蛋白特性有关的、需要考虑的因素：比如目的蛋白表达水平低，为检测到目的条带，需要提高上样量，结果中易出现杂带。◆以 PHD3 为例其也被称为 Egl 9 homolog 3 (EGLN3)，是一种广泛表达的脯氨酰羟化酶，理论分子量约为 27 kDa，它能羟基化靶蛋白如 HIF-1 alpha (Hypoxia-inducible factor) 上的脯氨酸残基。在氧含量丰富的情况下，HIF-1 的 alpha 链会被 PHD 家族成员羟基化，从而导致其泛素化和降解。在低氧压力下，羟化反应减弱，HIF-1 alpha 亚基保留，HIF-1 得以入核，增加低氧相关基因的表达。在典型的 HIF 信号通路中，PHD3 更多的影响 HIF-2 alpha。在大多数细胞类型中，HIF-2 alpha 受 PHD3 负调控，但有研究显示，在透明细胞性肾癌细胞 (ccRCC) 中 PHD3 高表达，并可维持 HIF-2 alpha 高表达。所以，对于 PHD3、HIF-1 alpha 和 HIF-2 alpha 三种蛋白，通常在常氧条件下，在许多组织或细胞中表达量偏低，难以检测到，通常细胞需经过诱导后才可见表达量升高。如上图所示，使用 HIF-1 alpha Antibody (NB100-105) 检测由 CoCl2 诱导前和诱导后，Caki-1 细胞中 HIF-1 alpha 的表达。使用 Novus Biologicals 的 EGLN1/PHD2 Antibody (NB100-138) 和 EGLN3/PHD3 Antibody (NB100-139) 显示 HIF 羟化酶在原代大鼠肝细胞的细胞核和膜定位。以 COS-7 细胞核提取物作为对照，Normox：常氧条件，Hypox：缺氧条件，Reox：复氧条件 (图片来源：doi: 10.2353/ajpath.2006.060360)。对此，针对 PHD3 的 WB 检测，有一些减少背景非特异条带的方法：降低上样量。蛋白上样量过高，可能会导致高背景和非特异条带。建议不要使用 2% SDS（阴离子）裂解缓冲液处理样品。因为这种裂解液有时会导致抗体的背景升高。使用 NP-40 或 RIPA 最好。在 Novus 官网有裂解液中各种成分的说明，可以点击此处参考。另外，将样品在 95°C 下煮沸 5 分钟冷却后再上样更好。减少转膜时间（通常 90V/1h，甚至更少），因为较小的蛋白质（例如 PHD3）转膜速度会更快。将膜在室温下封闭 1 小时，洗膜 3 次，每次 5 分钟。封闭时间过长和过度洗涤会导致高本底并阻碍检测。用封闭液稀释一抗。前期验证发现 BSA 会引起该抗体产生高背景，所以我们建议使用封闭液 5% 脱脂牛奶稀释一抗。如果前期二抗工作浓度偏高，我们建议增加稀释比例，并只将二抗孵育 1 小时。设置去除一抗的对照实验以判断二抗的特异性。值得注意的是，上表的因素中，由蛋白翻译后修饰（如糖基化等）、蛋白多亚型而出现的多条带，并不是非特异条带，需要根据文献及对照实验来多方面判断。1. 由蛋白翻译后修饰造成的多条带现象TREM2 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-2) 是一种细胞表面的受体糖蛋白，理论分子量约为 25 kDa。成熟 TREM2 包括一个 V-type Ig-like 胞外区域，一个跨膜区和一个短的胞质区。可溶形式的 TREM2 ECD 是由选择性剪接或蛋白水解产生，而细胞质区域可以通过酶裂解而释放。通过 Uniprot 数据库发现 TREM2 有 2 个糖基化位点，文献中 TREM2 呈现多条带且大于理论分子量，故推测为糖基化的 TREM2。图片来源：UniprotWB 检测 THP-1 细胞裂解物中人 TREM2 的表达。用 0.2 μg/mL 山羊抗人 TREM2 抗原亲和纯化的多克隆抗体 (Human TREM2 Antibody,货号 AF1828) 和 HRP 标记的抗山羊 IgG 二抗 (货号 HAF109) 检测 PVDF 膜。在约 28 kDa 及以上的位置检测到多个条带（本实验在还原条件下，使用免疫印迹缓冲液 1 组）。因此，如需在天然样品中检测未被糖基化的 TREM2，可尝试去糖基化实验，使用去糖基化试剂盒或使用 PNGase enzymes (Catalog # 9586-GH,9109-GH,7695-GHP)。后续排除非特异条带的干扰，可做只孵育二抗的阴性对照，更换封闭液（如将 BSA 换为脱脂牛奶），或者尝试 IP 实验。2. 目的蛋白被酶切后产生不同亚型，造成多条带现象Brevican（也称为 BEHAB）是属于 lectican 家族的蛋白聚糖。Brevican 存在于中枢神经系统，由星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元表达。其中心 (GAG) 区域后端被截短，形成一个 GPI 锚定的剪接体。此外 Brevican 还可被多种蛋白酶水解，形成许多不同的短片段。如下图所示，在天然健康样品中可检测到两条带，推测为 Brevican 被蛋白酶裂解后的产物，约为 60 kD 和 90 kD。WB 检测人小脑组织和人脑运动皮层组织的裂解物中 Brevican 的表达。用 0.1 g/mL 绵羊抗人/大鼠 Brevican 多克隆抗体 (货号 AF4009) 和 HRP 标记的驴抗绵羊 IgG 多克隆抗体 (货号 HAF016) 检测 PVDF 膜。在大约 60 kDa 和 90 kDa 检测到 Brevican 的特异性条带（本实验在还原条件下，使用免疫印迹缓冲液组 1）。高背景，条带去污小妙招有时目的条带已隐约可见，但背景较深（如下图），这种情况虽也是实验操作或试剂造成，可能为膜的空白处与一抗或二抗结合、封闭剂未充分溶解、HRP 聚集等，但与非特异条带相比，容易改善，下面即为造成 WB 高背景的原因及改善方式。又如：1. 封闭时间不足改善方式：增加封闭时间和/或温度，增加封闭剂的浓度（尝试增加至 10%），更改封闭剂（脱脂牛奶或 BSA），在抗体缓冲液中加入封闭剂（也可增加封闭剂浓度）。2. 使用了错误的封闭剂当检测磷酸化蛋白时，不推荐用脱脂牛奶作为封闭剂，因为牛奶和酪蛋白中富含磷酸化蛋白。3. 抗体浓度偏高，导致非特异性结合改善方式：降低一抗或二抗的浓度，在抗体缓冲液中加入封闭剂，做去除一抗的对照实验以判断二抗的特异性。4. 清洗次数不足，非结合抗体未完全洗净需要增加洗膜次数和/或洗膜时间。5. 膜在实验过程中风干确保膜在 WB 实验过程中不会变干。6. 曝光时间过长降低曝光时间，设置不同的检测时间点，逐步曝光。7. 检测试剂太灵敏在纯水中稀释检测试剂或使用灵敏度较低的检测试剂。除此之外，对于 R&D Systems 品牌验证过 WB 的抗体，通常会在产品页面给出检测体系建议，避免客户使用不合适的体系导致非特异条带和高背景。Bio-Techne 旗下子品牌 R&D Systems 和 Novus Biologicals 拥有 10w+ 种一抗，在研发过程中，选择活性蛋白作为免疫原，经过严格的抗体验证。其中，经过基因敲除 (KO) 验证的 WB 抗体就将近 3000 种，极大地保障了抗体的特异性和实验的可重复性。KO 验证的 WB 抗体产品列表（部分）（上下滑动阅览）点亮开学季赢双重特惠购买 Bio-Techne 旗下 R&D Systems、Novus Biologicals、Tocris、ACD 品牌产品，享双重特惠！◆促销时间：2020 年 8 月 31 日~2020 年 10 月 30 日◆特惠一：下单即送开学安心礼一份肯德基 50 元抵用券一张或温度计一支；◆特惠二：单笔订单满以下金额，加赠指定大礼单笔订单金额 ≥ 1 万，加赠 X5 天猫精灵或 M1 投影虚拟键盘；单笔订单金额 ≥ 2 万，加赠 59s 紫外灭菌袋或小度 X8 智能屏或 600 元知名品牌咖啡卡。◆活动规则：本活动仅限中国大陆地区科研客户（含医院、科研院所、大专院校等）；下单请标注促销码 MKT3202008005TH，否则不享受赠品；活动期间一个课题组最多发放 1 次礼品，订单不可累积；本促销不与其他特价及促销共享；本活动最终解释权归 Bio-Techne。图文来源：Bio-Techne题图来源：图虫创意

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